用 BCA 法（如羅氏 BCA Protein Assay Kit）檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，確保上樣量≥20 μg（或目標(biāo)蛋白含量≥1 pg）；

提取時(shí)添加新鮮的蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail，含 6 種抑制劑，可抑制絲氨酸 / 半胱氨酸蛋白酶等），避免蛋白質(zhì)降解；

根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇凝膠濃度（參考：10-50 kDa 用 15% 凝膠，50-100 kDa 用 10% 凝膠，100-200 kDa 用 8% 凝膠），電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色凝膠，確認(rèn)蛋白已進(jìn)入凝膠且未跑穿；

轉(zhuǎn)膜前用甲醇浸泡 PVDF 膜 10 秒（激活羥基），轉(zhuǎn)膜后用麗春紅 S 染色膜，觀察是否有蛋白質(zhì)條帶（若有則證明轉(zhuǎn)膜成功，無(wú)則檢查轉(zhuǎn)膜方向或緩沖液）；

核對(duì)一抗說(shuō)明書(shū)，確認(rèn)種屬匹配（如檢測(cè)人 EGFR 需用抗人 EGFR 抗體，而非抗小鼠 EGFR），優(yōu)先選擇經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的單克隆抗體（如羅氏 Anti-EGFR Monoclonal Antibody，經(jīng) WB 驗(yàn)證，特異性＞99%）；

調(diào)整一抗?jié)舛龋ㄍ扑]起始濃度 1:1000-1:5000），4℃孵育過(guò)夜（延長(zhǎng)結(jié)合時(shí)間），洗膜時(shí)用 TBST 緩沖液（含 0.1% Tween-20）充分洗滌（3 次 ×15 分鐘），避免未結(jié)合抗體殘留；

使用新鮮的 ECL 底物（如羅氏 Lumi-Light™ Plus Substrate，發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 8 小時(shí)），先進(jìn)行 5 分鐘預(yù)曝光，若信號(hào)弱則延長(zhǎng)至 10-30 分鐘，或使用高靈敏度成像儀（如羅氏 ChemiDoc™ MP Imaging System，檢測(cè)下限達(dá) 0.1 pg）。

確保上樣緩沖液中 β- 巰基乙醇終濃度為 5%，95℃加熱 10 分鐘（而非 5 分鐘），使蛋白質(zhì)變性（線性化）；

若樣品鹽濃度高（如從高鹽緩沖液中提取），用透析袋（截留分子量 3 kDa）透析 24 小時(shí)（換液 3 次），或使用脫鹽柱（如羅氏 HiTrap™ Desalting Columns）去除鹽分；

使用新鮮配制的電泳緩沖液（Tris - 甘氨酸 - SDS 緩沖液，pH 8.3），避免反復(fù)使用（建議使用次數(shù)≤3 次）；

選擇預(yù)制膠（如羅氏 ExcelGel™ SDS 預(yù)制膠，工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，孔徑均勻性 CV 值＜5%），避免手動(dòng)制膠導(dǎo)致的聚合不均；

采用恒壓轉(zhuǎn)膜（而非恒流），根據(jù)膜面積調(diào)整電壓（如 7 cm×8 cm 膜用 25 V 轉(zhuǎn)膜 30 分鐘），轉(zhuǎn)膜時(shí)在冰浴中進(jìn)行（避免膜發(fā)熱）；

鋪膜時(shí)用玻璃棒輕輕滾動(dòng)，排除凝膠與膜之間的氣泡（可在膜上滴加少量轉(zhuǎn)膜緩沖液，幫助氣泡排出）。

若懷疑磷酸化修飾，可同時(shí)檢測(cè)磷酸化與非磷酸化形式（如用羅氏 Anti-p-ERK 與 Anti-ERK 抗體，前者條帶偏移，后者為標(biāo)準(zhǔn)分子量）；

若為糖基化修飾，用糖苷酶（如 PNGase F）處理樣品（37℃孵育 1 小時(shí)），去除糖鏈后再電泳，觀察條帶是否恢復(fù)至預(yù)期分子量；

嚴(yán)格按照目標(biāo)蛋白分子量選擇凝膠濃度（參考表 1），并使用蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（如羅氏 Precision Plus Protein™ Standards，含 10 種蛋白，分子量 10-250 kDa），每次實(shí)驗(yàn)均上樣標(biāo)準(zhǔn)品，校準(zhǔn)條帶位置；

控制電泳電壓（濃縮膠 80 V，分離膠 120 V），避免電壓過(guò)高（如 150 V）導(dǎo)致遷移速度異常；

蛋白質(zhì)提取后立即進(jìn)行電泳（或 - 80℃分裝保存，避免反復(fù)凍融），若需長(zhǎng)期保存，添加蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Mini EDTA-free，適合金屬蛋白酶抑制）。

根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇封閉液（參考表 2），如檢測(cè)磷酸化蛋白或生物素標(biāo)記抗體，優(yōu)先用 3% BSA（如羅氏 Albumin from Bovine Serum，無(wú)內(nèi)源性磷酸酶與生物素），避免用脫脂牛奶；

延長(zhǎng)封閉時(shí)間（室溫 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜），封閉過(guò)程中持續(xù)搖床振蕩（50 rpm），確保封閉液均勻覆蓋膜表面；

降低一抗?jié)舛龋ㄈ鐝?1:500 調(diào)整為 1:2000），并進(jìn)行梯度稀釋實(shí)驗(yàn)（1:1000、1:2000、1:5000），選擇 “條帶清晰且背景低" 的最佳濃度；

選擇交叉反應(yīng)率低的二抗（如羅氏 HRP-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG，經(jīng)親和純化，與小鼠 IgG 交叉反應(yīng)率＜0.5%），二抗?jié)舛瓤刂圃?1:5000-1:10000；

使用新鮮開(kāi)封的 ECL 底物，避免反復(fù)使用（單次使用后丟棄剩余底物）；

操作時(shí)戴無(wú)粉手套，避免用手直接接觸膜（可使用鑷子夾取膜邊緣），膜的存放環(huán)境避免熒光燈直射（防止熒光物質(zhì)激發(fā)）。

優(yōu)先使用單克隆抗體（如羅氏 Anti-KRAS Monoclonal Antibody，僅識(shí)別 KRAS 蛋白的特定表位，交叉反應(yīng)率＜0.1%），避免使用多克隆抗體；

查閱抗體說(shuō)明書(shū)，確認(rèn)是否有 WB 驗(yàn)證數(shù)據(jù)（如是否標(biāo)注 “僅在 42 kDa 處出現(xiàn)單一條帶"），選擇經(jīng)過(guò)同行評(píng)審的抗體；

提取后立即添加蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail），并在 - 80℃分裝（避免反復(fù)凍融導(dǎo)致降解）；

確保上樣緩沖液中 SDS 濃度為 2%，95℃加熱 10 分鐘，使蛋白質(zhì)解聚（避免二聚體形成）；

上樣時(shí)避免樣品溢出（每個(gè)泳道上樣量不超過(guò)泳道體積的 80%），電泳時(shí)使用新鮮緩沖液，避免蛋白擴(kuò)散；

轉(zhuǎn)膜后用麗春紅 S 染色，確認(rèn)相鄰泳道無(wú)蛋白交叉污染，若有則增加泳道間距或降低上樣量。

若目標(biāo)蛋白豐度低（如血清中的細(xì)胞因子），使用免疫沉淀（IP）富集（如羅氏 Protein G Sepharose™ 4 Fast Flow，特異性結(jié)合抗體 - 抗原復(fù)合物），富集后再進(jìn)行 WB 實(shí)驗(yàn)；

增加上樣量（如從 10 μg 增至 30 μg），但需注意避免過(guò)載（導(dǎo)致條帶飽和，影響定量）；

選擇高親和力一抗（如羅氏 Anti-p53 Antibody，KD=10?12 mol/L，結(jié)合能力是普通抗體的 1000 倍），二抗選擇高偶聯(lián)效率的產(chǎn)品（如羅氏 HRP-Conjugated 二抗，DOL=2-3）；

使用增強(qiáng)型 ECL 底物（如羅氏 Lumi-Light™ Plus Substrate，發(fā)光強(qiáng)度是普通底物的 5 倍），延長(zhǎng)曝光時(shí)間（如從 1 分鐘增至 10 分鐘）；

使用高靈敏度成像儀（如羅氏 ChemiDoc™ MP Imaging System，配備高分辨率 CCD 相機(jī)，檢測(cè)下限達(dá) 0.1 pg），避免使用 X 光片（曝光時(shí)間固定，難以捕捉弱信號(hào)）。