一、使用前準(zhǔn)備

1. 器材與試劑

• 計(jì)數(shù)板：常見(jiàn)類型包括改良 Neubauer 計(jì)數(shù)板（規(guī)格：1×1×0.1 mm3，分 9 個(gè)大方格）、一次性塑料計(jì)數(shù)板（如 CHET4-SD100-002）。

• 工具：顯微鏡（配備 10× 物鏡）、微量移液器（10~100 μL）、蓋玻片（專用或 22×22 mm 標(biāo)準(zhǔn)玻片）、細(xì)胞懸液、臺(tái)盼藍(lán)染色液（如需區(qū)分死活細(xì)胞）。

2. 計(jì)數(shù)板預(yù)處理

• 清潔：用無(wú)水乙醇或 75% 酒精擦拭計(jì)數(shù)板表面，再用無(wú)塵紙擦干，避免油脂或雜質(zhì)影響液體鋪展。

• 安裝蓋玻片：將蓋玻片平穩(wěn)覆蓋在計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)上方，確保無(wú)氣泡且邊緣緊密貼合（通過(guò)毛細(xì)作用固定）。

二、操作步驟

1. 細(xì)胞懸液制備

• 混勻樣本：用吸管或移液器反復(fù)吹打細(xì)胞懸液 3~5 次，確保細(xì)胞均勻分散（避免沉淀導(dǎo)致取樣偏差）。

• 稀釋（如需）：若細(xì)胞濃度過(guò)高（如 >1×10? cells/mL），需用培養(yǎng)基或 PBS 按比例稀釋（如 1:10），使計(jì)數(shù)時(shí)每個(gè)中方格細(xì)胞數(shù)控制在 5~50 個(gè)（便于統(tǒng)計(jì)）。

2. 加樣

• 用微量移液器吸取 10~20 μL 細(xì)胞懸液，沿蓋玻片邊緣緩慢滴加（避免直接滴在計(jì)數(shù)區(qū)中央）。

• 液體通過(guò)毛細(xì)作用自動(dòng)鋪展并覆蓋計(jì)數(shù)區(qū)，確保無(wú)氣泡、無(wú)液滴溢出邊緣（若有氣泡需重新清潔計(jì)數(shù)板并加樣）。

3. 靜置沉降

• 加樣后將計(jì)數(shù)板水平放置于顯微鏡載物臺(tái)上，靜置 1~2 分鐘，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板底部（避免懸浮細(xì)胞導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差）。

4. 顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)

• 低倍鏡定位：先用 10× 物鏡找到計(jì)數(shù)板的中央大方格（含 25 個(gè)中方格或 16 個(gè)中方格，根據(jù)計(jì)數(shù)板類型而定）。

• 高倍鏡計(jì)數(shù)：切換至 20× 或 40× 物鏡，按對(duì)角線原則選擇 4 個(gè)角的中方格 + 中央中方格（共 5 個(gè)中方格）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

• 壓線細(xì)胞處理：遵循 “計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右" 原則，避免重復(fù)計(jì)數(shù)。

• 死活細(xì)胞區(qū)分：若加入臺(tái)盼藍(lán)，活細(xì)胞透明，死細(xì)胞染成藍(lán)色，需分別計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率（存活率 = 活細(xì)胞數(shù) / 總細(xì)胞數(shù) × 100%）。

5. 計(jì)算細(xì)胞濃度

• 公式推導(dǎo)：

• 若計(jì)數(shù) 5 個(gè)中方格的細(xì)胞總數(shù)為 $N$，稀釋倍數(shù)為 $D$，則：$\text{細(xì)胞濃度（cells/mL）}=\frac{N}{5}\times 25\times 10^4\times D=N\times 5\times 10^4\times D$
  （原理：5 個(gè)中方格體積為 $5\times 0.1{\text{mm}}^3=0.5\mu \text{L}=5\times 10^{?4}\text{mL}$，需換算為 1 mL 的濃度）。

三、注意事項(xiàng)

1. 操作規(guī)范性

• 避免細(xì)胞損傷：吹打懸液時(shí)力度適中，避免劇烈震蕩導(dǎo)致細(xì)胞破裂（尤其對(duì)貼壁細(xì)胞或脆弱細(xì)胞）。

• 加樣量精準(zhǔn)：移液器需定期校準(zhǔn)，加樣時(shí)保持垂直角度，避免液體殘留于槍頭或管壁。

• 溫度控制：細(xì)胞懸液和計(jì)數(shù)板需保持室溫（20~25℃），避免溫度差異導(dǎo)致細(xì)胞活性變化或液體揮發(fā)。

2. 計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性優(yōu)化

• 重復(fù)計(jì)數(shù)：同一懸液制備 2~3 個(gè)計(jì)數(shù)板樣本，取平均值（若單次結(jié)果偏差 >10%，需重新實(shí)驗(yàn)）。

• 適宜濃度范圍：理想計(jì)數(shù)濃度為 1×10?~1×10? cells/mL，濃度過(guò)低時(shí)建議離心富集（如 500×g 離心 5 分鐘，棄上清后重懸）。

3. 污染與損耗控制

• 一次性計(jì)數(shù)板：開(kāi)封后立即使用，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中導(dǎo)致灰塵污染。

• 玻璃計(jì)數(shù)板：使用后及時(shí)用清水沖洗（勿用硬物刮擦），晾干后存放于干燥盒中，避免霉菌滋生。

• 生物安全：處理感染性樣本（如病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞）時(shí)，需在生物安全柜中操作，計(jì)數(shù)板用后需高壓滅菌再丟棄。

4. 結(jié)果記錄與分析

• 記錄計(jì)數(shù)日期、樣本信息、稀釋倍數(shù)、各中方格細(xì)胞數(shù)及死活細(xì)胞比例，便于溯源和誤差分析。

• 若結(jié)果異常（如與歷史數(shù)據(jù)偏差 >20%），需排查懸液混勻度、加樣氣泡、計(jì)數(shù)板清潔度等因素，必要時(shí)更換新計(jì)數(shù)板。

四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

五、適用場(chǎng)景與替代方案

• 常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)：適用于懸浮細(xì)胞（如 PBMC、酵母）和消化后的貼壁細(xì)胞（如 HEK293、HeLa）。

• 高精度需求場(chǎng)景：若需自動(dòng)化計(jì)數(shù)或減少人為誤差，可選用熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)板（配合熒光顯微鏡）或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（如 TC20、Countess III）。