LKT Labs M5675 內(nèi)源性多肽科研應(yīng)用指南

——高純度生物活性肽的功能研究與分子機(jī)制解析

一、產(chǎn)品特性與質(zhì)量控制

1.1 多肽基本信息

序列：H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH（甲硫氨酸腦啡肽）

分子量：573.7 Da（MALDI-TOF驗(yàn)證）

純度：≥98%（HPLC，C18反相色譜）

儲(chǔ)存條件：-20℃干燥避光（穩(wěn)定性≥2年）

1.2 生物活性驗(yàn)證

檢測(cè)指標(biāo)M5675結(jié)果文獻(xiàn)參考范圍

μ-阿片受體親和力IC??=12.8 nM10-15 nM

半衰期（血漿）2.3分鐘1.5-3分鐘

細(xì)胞穿透效率＞80%（10μM）需載體輔助

1.3 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

低內(nèi)毒素：＜0.1 EU/μg（LAL檢測(cè)）

同位素標(biāo)記可選：13C/1?N全標(biāo)記（定制服務(wù)）

二、實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

2.1 受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

復(fù)制

1. 膜制備：  

   - 轉(zhuǎn)染μ受體HEK293細(xì)胞，差速離心獲取膜蛋白  

2. 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合：  

   - 加入3H-DAMGO（1 nM）和梯度濃度M5675（0.1-1000 nM）  

   - 4℃孵育90分鐘  

3. 檢測(cè)：  

   - GF/B濾膜收集，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)量  

數(shù)據(jù)分析：

用GraphPad Prism擬合抑制曲線（非線性回歸）

2.2 細(xì)胞功能研究

cAMP檢測(cè)方案：

復(fù)制

1. 預(yù)處理：Forskolin（10 μM）激活A(yù)C  

2. 加入M5675（0.1-10 μM），37℃孵育15分鐘  

3. 裂解后ELISA檢測(cè)cAMP水平  

鈣流測(cè)定：Fluo-4 AM負(fù)載，共聚焦實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

三、數(shù)據(jù)解讀與問題排查

3.1 預(yù)期結(jié)果

典型劑量效應(yīng)曲線：

EC??≈50 nM（cAMP抑制實(shí)驗(yàn)）

最大效應(yīng)＞70%抑制率

3.2 常見問題分析

現(xiàn)象可能原因解決方案

活性顯著降低多肽降解（反復(fù)凍融）分裝單次使用量

非特異性效應(yīng)血清蛋白干擾使用無血清培養(yǎng)基

細(xì)胞響應(yīng)延遲內(nèi)化作用緩慢預(yù)處理細(xì)胞4℃ 30分鐘

四、技術(shù)問答（Q&A）

Q1：能否用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)？

需聯(lián)合 DPDPE（δ受體拮抗劑） 阻斷非靶向效應(yīng)，推薦劑量0.1 mg/kg（小鼠i.v.）

Q2：與抗體檢測(cè)的兼容性？

需選擇 非序列依賴性抗體（如Anti-ENK抗體，Cat. AB1565）

文檔優(yōu)化建議：

插入 【受體信號(hào)通路示意圖】 標(biāo)注作用位點(diǎn)

添加 凍融穩(wěn)定性測(cè)試數(shù)據(jù) 曲線圖

關(guān)鍵步驟用 ??警示框 標(biāo)注（如"避免酸性緩沖液"）